É comum, tanto no Windows XP quanto no Vista, algum processo escuso acessar o pendrive e não nos deixar "Remover hardware com segurança". No XP, uso um programa chamado "Handle", da sysinternals.com, para localizar o aplicativo chato. No Vista há um meio melhor:

1. Feche todas as janelas (do explorer) que estejam listando o conteúdo do pendrive.
2. Abra o "Computador" e clique com o botão direito sobre o ícone do pendrive, opção "Ejetar". Depois de alguns segundos, o volume do pendrive torna-se "Disco removível".
3. Finalmente, clique novamente com o botão direito sobre o ícone do pendrive, opção "Remover hardware com segurança". Desta vez não haverá pentelhação.